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腦血管疾病是威脅人類健康的重大疾病之一，包 括缺血性和出血性兩類[1]。缺血性腦血管病(ischemic cerebrovascular disease，ICVD)在老年人中具有高發(fā) 病率、患病率、致殘率和死亡率，且發(fā)病逐漸年輕化。 加大腦血管病防治力度，改善預(yù)后，預(yù)防并發(fā)癥，提高 腦血管疾病的療效是一項刻不容緩的重任。目前，雖 然對ICVD的治療取得了較大的進(jìn)步，在溶栓和（或） 取栓同時，也可使用神經(jīng)保護(hù)劑來避免或減少再灌 注損傷，但仍無一種神經(jīng)保護(hù)的藥物可使患者從中 獲益[2]，研究表明電針在ICVD中的應(yīng)用中能促進(jìn)其 功能恢復(fù)[3]，己是缺血性腦血管病的常規(guī)治法。本實 驗主要通過電針來干預(yù)腦缺血大鼠模型，為針刺治療 ICVD提供實驗研究依據(jù)。
1材料
1.1實驗動物選擇18月齡，雄性，體質(zhì)量200?
250 g的SD大鼠80只，均購買并飼養(yǎng)于安徽中醫(yī) 藥大學(xué)實驗動物中心，預(yù)適應(yīng)1周后方開始實驗。 大鼠選用清潔級顆粒飼料喂養(yǎng)，并予自由飲食及飲 水，視墊料清潔的程度更換墊料。飼料和墊料均購文草編號：1000-2723(2018) 04-0025-04 買于安徽中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心，飼養(yǎng)環(huán)境模擬 標(biāo)準(zhǔn)日夜系統(tǒng)。
1.2實驗儀器G6805型電針治療儀：蘇州醫(yī)療用 品廠有限公司；電凝器；牙科鉆；華佗牌一次性針灸 針：蘇州，規(guī)格為直徑0.2 mm，針身長0.5寸；Barnes 迷宮測試板、圓形滾筒：上海欣軟XR-XB108型巴恩 斯迷宮視頻分析系統(tǒng)。
2實驗方法
2.1實驗分組80只SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組
(該組只行血管分離）、模型組、電針對照組、電針組， 每組20只。
2.2大腦中動脈閉塞大鼠模型的建立及成功與否檢
測的方法在室溫25 °C條件下，SD大鼠稱重后，根 據(jù)羅燕等[4]提出的熱凝閉大腦中動脈法制造局灶性 腦缺血大鼠模型：將SD大鼠右側(cè)臥位固定于手術(shù)臺 上，去除左側(cè)顳頂部的鼠毛，碘伏對顳頂部局部皮膚 消毒。左眼與左耳之間切開皮膚，鈍性分離顳肌，暴露 出顳骨翼板，術(shù)中避免損傷周圍血管及神經(jīng)等。用牙 科鉆經(jīng)顳骨翼板鉆至硬腦膜，用小咬骨鉗向下咬去部分顱骨，暴露大腦中動脈，用電凝器來凝閉大腦中動 脈(嗅束到大腦下靜脈），后縫合顳肌及皮膚。
假手術(shù)組：同上操作到暴露大腦中動脈，不進(jìn)行 熱凝閉。
大鼠蘇醒后參照Zea Longa E等[5]提出的神經(jīng)行 為學(xué)評估法進(jìn)行評分，評分1~3分表示造模成功，采 用差額補(bǔ)充的方法保證每組實驗的例數(shù)。
2.3處理方法電針組：造模成功后將不予麻醉的 大鼠固定在自制鼠夾上。根據(jù)華興邦等[6]制定的大 鼠針灸穴位進(jìn)行定位，選用“醒腦開竅”針刺法[7]，主 穴取水溝、百會和雙側(cè)內(nèi)關(guān)、三陰交。先用捻轉(zhuǎn)、提插 瀉法刺激雙側(cè)內(nèi)關(guān)1 mm至筋間，刺激1 min，留針 30 min;次用雀啄法由鼻中隔下部向上斜刺水溝1 mm，強(qiáng)刺激1 min;再應(yīng)用提插法直刺三陰交5 mm， 持續(xù)1 min;后刺百會穴，取向前或向后斜刺2 mm，采用平補(bǔ)平瀉捻轉(zhuǎn)手法刺激1 min，留針30 min。留針期間，分別用G6805電針治療儀連接內(nèi)關(guān) 和三陰交穴位的針柄，施以疏密波，調(diào)整電壓為2~4 V，頻率為2/100 Hz，以針刺部位輕微抖動為刺激強(qiáng) 度。第1次針刺在造模成功后的24 h內(nèi)進(jìn)行，以后每 天上午固定時間針刺1次，每7 d為1個療程（連續(xù) 針刺6 d，休息1 d)[8-9]。
電針對照組:SD大鼠不進(jìn)行任何手術(shù)，抓取、固 定方法、針刺穴位、方法、頻率、電針刺激參數(shù)等同電 針治療組。
假手術(shù)組、模型組:抓取、固定方法參數(shù)等同電針 組，但不進(jìn)行針刺。
2.4觀察指標(biāo)
2.4.1大鼠神經(jīng)行為學(xué)評分[5] 0分：無神經(jīng)缺損癥
狀；1分：將大鼠提尾倒懸時，左側(cè)前爪不能*伸 展;2分：爬行時左側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分：行走困難、向左側(cè)傾 倒;4分:不能自發(fā)行走，意識喪失。
2.4.2 Barnes記憶分析系統(tǒng)檢測訓(xùn)練過程:將大鼠 逐只放在圓形漆黑Barnes迷宮測試板上，測試板的 周圍有20個洞口，底部放置底盒的一個洞口稱之為 隱藏區(qū)，其余稱之為暴露區(qū)，每次訓(xùn)練開始時將大鼠 放置于隱藏區(qū)，讓其適應(yīng)30 s，然后將其放在迷宮中 央，自由選擇進(jìn)入隱藏區(qū)，每次訓(xùn)練240 s，每只老鼠 做完以后都用酒精對迷宮進(jìn)行擦拭。每天下午每只大 鼠連續(xù)訓(xùn)練2次，連續(xù)訓(xùn)練6 d。
測試過程：第1 d訓(xùn)練結(jié)束后按分組測試，然后 連續(xù)訓(xùn)練6 d后第7 d開始測試，按分組開始測試， 測試過程同訓(xùn)練過程，每只測試2次，Barnes迷宮
映了動物的空間記憶功能。
2.4.3滾筒掉落時間檢測選用直徑20 cm圓形滾 筒，設(shè)定轉(zhuǎn)速為5轉(zhuǎn)/min，測試時間為5 min，按照分 組將大鼠放在滾筒中，傾斜60。，每次可測試3只大 鼠，每只測試3次，記錄大鼠掉落平臺時間，長測試 時間為 5 min。
2.5統(tǒng)計學(xué)方法所有計量資料均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn) 差（X± s)表示，Barnes記憶持續(xù)時間、大鼠進(jìn)入隱藏 區(qū)的次數(shù)、進(jìn)入的潛伏期以及滾筒掉落時間等參數(shù) 的比較采用單因素方差分析。統(tǒng)計結(jié)果，均由SPSS for windows 19.0自動運算完成。P<0.01為有顯著統(tǒng) 計學(xué)意義，P<0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義，P>0.05為無統(tǒng) 計學(xué)意義。
3結(jié)果
3.1神經(jīng)行為功能評分假手術(shù)組、電針對照組未 見神經(jīng)行為功能缺損癥狀，電針后神經(jīng)行為功能評 分較模型組降低，其中電針24 h降低無統(tǒng)計學(xué)意義 CP=0.23)，電針7 d和14 d降低均有顯著統(tǒng)計學(xué)意 義（P7d = 0.002，d < 0.001)說明電針可改善缺血性 腦卒中大鼠的神經(jīng)行為功能評分。見表1。
表1各組大鼠神經(jīng)行為功能評分比較(X±s，n=10,分)
分組 | 24 h | 7 d | 14 d |
模型組 | 2.97±0.41 | 2.82±0.34 | 2.78±0.31 |
假手術(shù)組 | 0.00±0.00 | 0.00±0.00 | 0.00±0.00 |
電針對照組 | 0.00±0.00 | 0.00±0.00 | 0.00±0.00 |
電針組 | 2.78±0.28 | 2.38±0.41** | 1.73±0.43** |
注：與模型組比較，**P<0.01
3.2進(jìn)入隱藏區(qū)的潛伏期分析結(jié)果假手術(shù)組、電
針對照組大鼠進(jìn)入隱藏區(qū)的潛伏期均較短，兩者比 較差異無統(tǒng)計學(xué)意義CP24 h = 0.94、7 d = 0.90、PM d = 0.90)，說明電針刺激對大鼠進(jìn)入隱藏區(qū)的潛伏期無 直接影響。電針后大鼠進(jìn)入隱藏區(qū)的潛伏期較模型組 縮短，其中電針24 h縮短有統(tǒng)計學(xué)意義CP24h<0.05)， 電針7d和14d縮短有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P7〆 0.001，PMd<0.001)，說明電針可改善缺血性腦卒中大 鼠進(jìn)入隱藏區(qū)的潛伏期。見表2。
表2各組大鼠進(jìn)入隱藏區(qū)的潛伏期比較(x±s，n=10,分) 分組 24 h 7 d 14 d
238.57±2.74
3.27±0.97
3.19±1.33
233.10±4.11*
注：與模型組比較，*P<0.05;與模型組比較，**P<0.01
3.3 Barnes記憶持續(xù)時間假手術(shù)組、電針對照組 大鼠Barnes記憶持續(xù)時間差異無統(tǒng)計學(xué)意義CPz4h = 0.89、P7d = 0.74、PMd = 0.86)，說明電針刺激對大鼠 Barnes記憶持續(xù)時間無直接影響；電針后Barnes記 憶持續(xù)時間較模型組延長，電針24 h、7 d和14 d延 長均有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P4 h < 0.001，P/ d < 0.001，d <0.001)，說明電針可改善缺血性腦卒中大鼠的空間 記憶能力。見表3。
表3各組大鼠Barnes記憶持續(xù)時間比較(x眘，10, s)
分組 | 24 h | 7 ds | 14 d |
模型組 | 0.00±0.00 | 0.00±0.00 | 0.00?.00 |
假手術(shù)組 | 14.79±2.75 | 16.35±3.01 | 18.66±3.77 |
電針對照組 | 14.92±3.23 | 16.71±2.93 | 18.41?.66 |
電針組 | 0.00±0.00 | 7.13±2.42** | 12.61±3.93** |
注：與模型組比較，**P<0.01
3.4滾筒掉落時間分析結(jié)果假手術(shù)組、電針對照
組大鼠滾筒掉落時間差異無統(tǒng)計學(xué)意義CP24h = 0.41、 P7d = 0.68、PMd = 0.74)，說明電針刺激對大鼠滾筒掉 落時間無直接影響；電針后滾筒掉落時間較模型組延 長，其中電針24 h延長無統(tǒng)計學(xué)意義（P = 0.53)，電 針7 d和14 d延長均有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P/d< 0.001， PMd<0.00)說明電針可延長大鼠從滾筒上掉落的 時間。見表4。
表4各組大鼠滾筒掉落時間比較(x眘，n=10 , s)
分組 24 h 7 d 14 d
模型組 38.78?1.16 55.60?3.59 79.25?4.10
假手術(shù)組 289.16?.17 289.49?.69 290.87?.72
電針對照組 284.77?3.78 286.0?2.89 289.17?0.32
電針組 42.13?1.27 109.54?1.99** 178.93?1.68**
注：與模型組比較，**P<0.01 4討論
缺血性腦血管病（ICVD)屬于中醫(yī)學(xué)“中風(fēng)”范 疇，其病機(jī)多是陰陽失調(diào)，血氣運行受阻，血瘀滯絡(luò)， 蒙蔽清竅而成[10]。針刺治療，包括頭皮針、電針等因具 有經(jīng)濟(jì)、簡便、療效確切等特點而廣泛用于腦血管病 的治療[11]。
采用石學(xué)敏院士“醒腦開竅”針刺法來刺激該實 驗大鼠，此法中的水溝、百會穴有醒腦、開竅、定志的 功效。大鼠水溝穴的定位取唇裂鼻尖下1 mm正中 處，直或向上刺1 mm;百會為“諸陽之會”，取頂骨正 中，向前、后斜刺2 mm[6]。關(guān)于電針?biāo)疁涎ㄖ委熌X血 管病的機(jī)制研究頗多，李莎莎等[12]發(fā)現(xiàn)電針刺激水溝 穴可能通過調(diào)控微小RNA-126及其靶基因、促進(jìn)腦 血管新生，從而提高反應(yīng)神經(jīng)功能損傷程度的 Berderson評分，促進(jìn)大鼠腦缺血后的神經(jīng)功能恢復(fù)。 Wang等[13]研究發(fā)現(xiàn)電針?biāo)疁涎ㄍㄟ^大電導(dǎo)Ca2+-激 活K+通道(BKCa通道）的過度激活和表達(dá)可能是腦 缺血/再灌注損傷后神經(jīng)元延遲死亡，從而改善缺血 再灌注大鼠神經(jīng)功能。該實驗選用水溝穴既有“醒腦 開竅”作用，又有現(xiàn)代機(jī)制方面研究的支撐。該實驗發(fā) 現(xiàn)通過“醒腦開竅”刺法，可改善缺血性卒中大鼠的神 經(jīng)功能評分，與李莎莎、Wang等的研究結(jié)果類似。
認(rèn)知和記憶功能的研究屬于神經(jīng)心理學(xué)研究范 疇，神經(jīng)心理學(xué)是當(dāng)今“腦科學(xué)時代”的一門新興學(xué) 科，它把腦當(dāng)作心理活動物質(zhì)載體從而研究腦與行為 的關(guān)系[1]。臨床檢測記憶或認(rèn)知功能有韋氏記憶量 表、MMSE簡易智能精神狀態(tài)量表以及MoCA量表 等[14]，研究[15-16]發(fā)現(xiàn)電針刺激可改善腦卒中后患者的 記憶和認(rèn)知功能。然而，對于動物實驗的研究，相關(guān)量 表完成困難，1976年Barnes發(fā)明了 Barnes迷宮，主 要用于測量動物的空間記憶功能，這與Morris水迷 宮相比對動物的刺激更少[17]。近年，隨著信號通路的 不斷被挖掘，研究動物認(rèn)知和記憶功能則多基于認(rèn)知 和記憶相關(guān)傳導(dǎo)通路[18]、機(jī)制方面，Huang等[19]發(fā)現(xiàn)電 針百會、神庭穴可下調(diào)大腦中動脈閉塞-再灌注大鼠 的促炎因子白細(xì)胞介素-1P表達(dá)水平，抑制星形膠質(zhì) 細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞P2嘌呤受體介導(dǎo)的神 經(jīng)炎性損傷。Lin等[20]通過電針百會、神庭穴可抑制腦 缺血再灌注大鼠模型的基質(zhì)金屬蛋白酶-2和基質(zhì)金 屬蛋白酶-9的表達(dá)，減輕腦超微結(jié)構(gòu)損傷，從而提高 其記憶能力。Yu等[21側(cè)從另一角度研究記憶能力，發(fā) 現(xiàn)電針百會、大椎穴可提高事件相關(guān)電位P300,改善 腦梗死大鼠學(xué)習(xí)記憶能力。誘發(fā)電位中的事件相關(guān)電 位主要反映認(rèn)知過程中大腦電生理的變化，其中 P300電位應(yīng)用廣泛。該實驗通過觀察大鼠Barnes 記憶持續(xù)時間、滾筒掉落時間等指標(biāo)發(fā)現(xiàn)電針可改善 腦梗死模型大鼠的記憶功能。
該實驗研究結(jié)果提示，Barnes迷宮實驗表明電 針對照組、假手術(shù)組大鼠進(jìn)入隱藏區(qū)的潛伏期縮 短、記憶持續(xù)時間延長優(yōu)于電針組，電針組優(yōu)于模 型組；滾筒掉落時間測試也表明電針對照組、假手 術(shù)組掉落時間延長優(yōu)于電針組，電針組優(yōu)于模型 組，反應(yīng)“醒腦開竅”針刺法能使大腦中動脈閉塞模 型大鼠記憶
及運動能力改善，且在一定范圍內(nèi)，隨 著電針時間的延長，記憶及運動功能改善越明顯。 Barnes記憶分析系統(tǒng)及滾筒掉落時間可客觀地反映 大鼠記憶及運動功能的變化。
雖然大鼠行為學(xué)研究的指標(biāo)不能*等同于人 類，但由于倫理學(xué)的限制，先在動物模型上做實驗是 研究的必要途徑。周鵬[22]等發(fā)現(xiàn)電針治療腦缺血再灌 注損傷是通過多途徑，作用于多靶點來實現(xiàn)的。該實 驗?zāi)壳皟H觀察了神經(jīng)功能評分、Barnes記憶持續(xù)時 間、滾筒掉落時間等指標(biāo)，記憶相關(guān)信號通路的各個 靶點，甚至大鼠事件相關(guān)電位P300等的是筆者下一 步研究的方向。
